part1 (Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов — Хроматографические методы анализа)
Описание файла
Файл «part1» внутри архива находится в папке «Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов — Хроматографические методы анализа». PDF-файл из архива «Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов — Хроматографические методы анализа», который расположен в категории «книги и методические указания». Всё это находится в предмете «хроматография» из третьего семестра, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. .
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
Московский Государственный Университет имени М.В. ЛомоносоваХимический факультетКафедра аналитической химииШаповалова Е.Н., Пирогов А.В.Хроматографические методы анализаМетодическое пособие для специального курсаОтветственный редакторЧл.-корр. РАН, профессор О.А.ШпигунМосква, 2007Настоящее пособие составлено в соответствии с программой практическихзанятий и лекций специального курса «Хроматографические методы анализа» длястудентов 4 – 5 курсов химического факультета Московского государственногоуниверситета им.
М.В.Ломоносова. Пособие содержит описание практических работ(раздел 6), выполняемых студентами в рамках спецпрактикума по хроматографическимметодам. Для лучшего понимания материала и освоения практических навыков ванализе объектов окружающей среды перед описанием практических работ в пособиипредставлентеоретическийвысокоэффективнойматериалжидкостной,попланарнойотдельнымхроматографииразделамигазовой,капиллярномуэлектрофорезу (разделы 1– 5).
Раздел 7 посвящен особенностям эксплуатациихроматографических колонок для ВЭЖХ. Для закрепления полученных знаний вразделе 8 приводятся вопросы по рассмотренным вариантам хроматографии. Авторыблагодарят к.х.н.Глазкова И.Н. и м.н.с Бендрышева А.А. за предоставленныематериалы при написании пособия.Все замечания и пожелания студентов и преподавателей будут принятыавторами с глубокой благодарностью.2Оглавлениестр1.
Основные положения хроматографии42. Газовая хроматография112.2. Газо-адсорбционная хроматография212.3. Газо-жидкостная хроматография302.3. Капиллярная газовая хроматография342.4. Реакционная газовая хроматография462.5. Хромато-масс-спектрометрия513. Высокоэффективная жидкостная хроматография573.1. Молекулярная адсорбционная хроматография583.1.1. Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ)633.1.2. Использование ОФ ВЭЖХ для решения экологическихзадач743.2.
Ионная хроматография964. Планарная (тонкослойная) хроматография1105. Капиллярный электрофорез1306. Практические работы1437. Особенности эксплуатации колонок для ВЭЖХ1777.1. Подготовка растворителя и пробы1777.2. Типичные неисправности, способы обнаружения иустранения1807.3. Методические аспекты обеспечения высокойэффективности колонки1827.4. Проблемы изменения селективности колонок1897.5.
Проблемы воспроизводимости между параллельнымивводами пробы1917.6. Регенерация загрязненных колонок1948. Вопросы1979. Литература2033Хроматография в настоящее время является наиболее широкоиспользуемым методом исследования объектов окружающей среды.Хроматографический метод был предложен в 1903 году русскимученым М.С. Цветом. Он писал: «При фильтрации смешанного растворачерез столб адсорбента пигменты… расслаиваются в виде отдельных,различно окрашенных зон. Подобно световым лучам в спектре, различныекомпоненты сложного пигмента закономерно распределяются друг задругом в столбе адсорбента и становятся доступными качественномуопределению. Такой рассчвеченный препарат я назвал хроматограммой, асоответствующий метод анализа хроматографическим методом. РаботыМ.С.Цвета послужили фундаментом для развития остальных видовхроматографии для разделения как окрашенных, так и неокрашенныхсоединений, осуществляемых в любых средах.1.
Основные положения хроматографииХроматография – это метод разделения и определения веществ,основанный на распределении компонентов между двумя фазами –подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служиттвердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленкажидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляетсобой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногдапод давлением.Компоненты анализируемой смеси (сорбаты) вместе с подвижнойфазой передвигаются вдоль стационарной фазы.
Ее обычно помещают встеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. Взависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счетадсорбции или по какому-либо другому механизму) компоненты будут4перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компонентыостанутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степенивзаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, анекоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой (такиекомпоненты называются неудерживаемыми, а время их удерживанияопределяет “мертвое время” колонки).Таким образом происходит быстрое разделение сложных смесейкомпонентов.Следуетподчеркнутьследующиедостоинcтвахроматографических методов:1. Разделение носит динамический характер, причем акты сорбциидесорбции разделяемых компонентов повторяются многократно.
Этимобусловлена значительно большая эффективность хроматографическогоразделения по сравнению со статическими методами сорбции иэкстракции.2. При разделении используют различные типы взаимодействиясорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных.Это обуславливает возможность селективного разделения широкого кругавеществ.3. На разделяемые вещества можно накладывать различныедополнительные поля (гравитационное, электрическое, магнитное и др.),которые,изменяяусловияразделения,расширяютвозможностихроматографии.4. Хроматография – гибридный метод, сочетающий одновременноеразделение и определения нескольких компонентов.5.
Хроматография позволяет решать как аналитические задачи(разделение, идентификация, определение), так и препаративные (очистка,выделение, концентрирование). Решение этих задач можно сочетать,выполняя их в режиме “on line”.5Многочисленныеметодыклассифицируютсяпоагрегатномусостоянию фаз, механизму разделения и технике проведения разделения.Хроматографические методы различаются и по способу проведенияпроцесса разделения на фронтальный, вытеснительный и элюентный.Для решения аналитический задач используется элюентный метод,он имеет следующие достоинства:– дает наиболее полное разделение, поскольку зоны сорбатовразделены зонами элюента;– сорбент непрерывно регенерируется;– параметры удерживания хорошо воспроизводимы.Элюентная хроматограмма, являющаяся зависимостью сигналаприбора (ось ординат) от времени или объема подвижной фазы (осьабсцисс),представляетсобойсовокупностьпиковразделяемыхкомпонентов.
Обычно отдельный пик представляет собой гауссову кривую.Типичная хроматограмма приведена на рис. 1.AtR(1)tR(2)tmW(1)W(2)tРис. 1. Хроматограмма смеси двух веществРассмотримосновныехроматографическиепараметры,характеризующие поведение вещества в колонке. Время от момента вводаанализируемойпробыдомомента6регистрациимаксимумахроматографическогопиканазываютвременемудерживанияиобозначают – tR. Время удерживания складывается из двух составляющих– времени пребывания веществ в подвижной фазе ™ и временипребывания в неподвижной фазе (ts)Значение tm фактически равно времени прохождения черезхроматограф несорбируемого компонента. Значение tR не зависит отколичества пробы, вводимой в колонку, но зависит от природы вещества исорбента (если изотерма сорбции вещества линейна), а также от упаковкисорбента и может меняться от колонки к колонке.
Поэтому дляхарактеристики истинной удерживающей способности колонки следуетввести исправленное время удерживания ( t R′ )t ′ = tR – t m(1)RЧасто для характеристики удерживания используют удерживаемыйобъем – VR – объем подвижной фазы, который нужно пропустить черезколонку с определенной скоростью, чтобы элюировать вещество:.VR = F tR(2),3где F – объемная скорость потока подвижной фазы (см /с) или (мл/мин).По полученной хроматограмме смеси (рис. 1) можно рассчитатьэкспериментальные значения хроматографических параметров: факторудерживания(емкости)(k),коэффициентселективности(α),разрешение (RS) и оценить эффективность хроматографическойколонки.Фактор удерживания показывает во сколько раз дольше веществопребывает в неподвижной фазе, чем в подвижной.
Стараются выбиратьусловия хроматографического разделения таким образом, чтобы этавеличина составляла от 1,5 до 4. k рассчитывают по формуле:7V −V = t − tVtRk=mRmРасстояниемеждуm(3)mмаксимумамихроматографическихпиковопределяет селективность неподвижной фазы. Фактор разделения(коэффициент селективности) α есть мера относительного удерживанияилиотносительнойподвижностидвухразделяемыхвеществ,иописывается уравнением:α=t′R2t′= D2/D1(4)R1Для разделения двух веществ необходимо подобрать условия разделениятак, чтобы D1 ≠ D2 и α>1,00.Степеньразмыванияхроматографическогопикаопределяетэффективность колонки. Чем эффективнее колонка, тем уже пик, тембольшее число компонентов можно разделить за более короткое время, т.е.время анализа сокращается.
Количественно эффективность колонки можетбыть выражена числом теоретических тарелок N. Согласно концепциитеоретических тарелок хроматографическую колонку представляют какряд дискретных, соприкасающихся горизонтальных слоев, на которыхмгновенно устанавливается равновесие между неподвижной и подвижнойфазами, и акт сорбции-десорбции вещества повторяется многократно накаждом слое. Высота слоя – высота, эквивалентная теоретическойтарелке,обозначаетсячерезH.Междупараметрамисуществуетсоотношение:H = L/N(5),где L — длина колонки.Чем меньше H, тем большее число раз устанавливается равновесиемежду фазами при данной длине колонки, тем эффективнее разделениекомпонентов анализируемой смеси.8Из экспериментальных данных рассчитывают N по формуле: tR 16N = W 2(6),где W – ширина пика у основания.Разделение двух соседних пиков характеризуется разрешением Rs.Разрешение является мерой полноты разделения двух веществ.
part2 (Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов — Хроматографические методы анализа), страница 2
Описание файла
Файл «part2» внутри архива находится в папке «Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов — Хроматографические методы анализа». PDF-файл из архива «Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов — Хроматографические методы анализа», который расположен в категории «книги и методические указания». Всё это находится в предмете «хроматография» из третьего семестра, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. .
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Значения силы растворителя Si для полярныхнеподвижных фазГруппа( поСнайдеру)IРастворительSiн-Гексанн-Бутиловый эфирИзопропиловый эфирМетил-трет-бутиловыйэфирДиэтиловый эфир02,12,42,72,8II1-Бутанол2-Пропанол1-ПропанолЭтанолМетанолIIIТетрагидрофуранПиридинМетоксиэтанолДиметилформамидIVЛедяная уксусная кислотаФормамидVДихлорметан1,2-ДихлорэтанVIЭтилацетатМетилэтилкетонДиоксанАцетонАцетонитрилVIIТолуолНитробензолVIIIХлороформНитрометанВода1173,93,94,04,35,14,05,35,56,46,09,63,13,54,44,74,85,15,82,44,44,16,010,2Природа растворителя может влиять на размер пятна наносимойпробы. При нанесении пробы необходимо, чтобы: растворитель легкоудалялся со стартовой зоны, и растворимость анализируемых веществбыла бы не менее 0,01 г/мл.Пробы наносят в виде точки или полоски длиной 5-7 мм при помощикапилляра, пипетки на 0,1 мл или микрошприца, предварительно отметивстартовую линию на расстоянии 1,5 см от края пластинки.
Расстояниемежду отдельными пробами должно быть не менее 1 см. После этого ждут,когдарастворительиспарится,затемпластинкуопускаютвразделительную камеру с выбранной подвижной фазой. В зависимости оттого, в каком направлении поступает растворитель на пластинку,различаютметодывосходящей,нисходящейигоризонтальнойхроматографии. На рис. 30 показаны различные методы элюирования впланарной хроматографии. Применение многоступенчатого и двумерногоэлюирования позволяет повысить селективность разделения за счетРис.
30. Варианты элюирования компонентов в тонкослойной (планарной)хроматографии.118изменения элюирующей способности подвижной фазы. Однако во всехуказанных способах не удается исправить существенный недостаток ТСХ– низкую эффективность разделения, поскольку движение элюентаосуществляетсязасчеткапиллярныхсил.Вариантпланарнойхроматографии с принудительным движением элюента (под давлением)позволяетсущественноулучшитьэффективностьразделения.Этонаглядно подтверждает пример разделения лекарственных веществ наадсорбенте – силикагель 60 при элюировании смесью н-бутанол–хлороформ–метилэтилкетон–уксусная кислота (25 : 17 : 8 : 6), показанныйна рис.
31.Рис. 31. Хроматограммасмеси: 1 – стрихнин; 2 –эфедрин; 3 – метамфетамин;4 – фенметразин; 5 – метилфенидат; 6 – амфетамин; 7 –дезопинон; 8 – корамин;9 – кофеин; S – старт.а – под давлением, б – прииспользованииобычнойтонкослойнойхроматогра-фии.Идентификациякомпонентов.необходимообнаружитьихбесцветныхвеществ,первуюфизическимивметодами,Послеразделенияна хроматограмме. Дляочередь,основанныминаследуетвеществобнаружениявоспользоватьсяпоглощениисветаифлуоресценции. Для обнаружения веществ, поглощающих в УФ-области119спектра, часто применяют пластинки со слоем сорбента, содержащимфлуоресцирующее вещество или опрыскивают хроматограмму послеразделения смеси раствором флуоресцирующего вещества. При облучениипластинки УФ-излучением вещества, поглощающие в этой областиспектра, обнаруживаются в виде темных зон (пятен).
Флуоресцировать вУФ-свете способно значительное количество веществ, полученные пятнаимеют при этом различный оттенок. Для обнаружения флуоресцирующихвеществ или веществ, поглощающих в УФ-области спектра, используютисточники света с максимумами излучения в области 254 и 365 мкм.Помимооптическихметодовобнаружениявеществ,применяютхимические методы проявления хроматограмм. К химическим методамотноситсяиспользование«универсальныхреагентов»иреагентов,избирательно реагирующих с определенными функциональными группамиопределяемых соединений.Дляколичественнойоценкисодержаниявеществавхроматографических зонах используют различные методы:1.
Определение с удалением хроматографической зоны с пластинкиможно проводить двояким образом: переносом хроматографической зонывместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны сослоя сорбента.2. Определение соединений непосредственно на пластинке методомвизуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски ссоответствующими параметрами пятен стандартных образцов3. Метод денситометрии, повышающий точность результатовопределения, основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФсветеспомощью«хроматографическихспектрофотометров»–денситометров.
Денситометры позволяют измерять поглощение светавеществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, атакже флуоресценцию и ее тушение. Режим пропускания доступен, если120только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимойобласти спектра. В УФ-области регистрацию в режиме пропусканияосуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля иподложки хроматограммы.4. Метод видеоденситометрии – сравнительно новый метод дляколичественной обработки хроматограмм. Принцип метода заключается вовведенииизображениявидеокамерыилиинтенсивностейхроматограммыцифровойпятенкамерыстандартныхвсикомпьютерспоследующимопределяемыхпомощьюсравнениемсоединений.Видеоденситометр включает осветительный блок, видеокамеру с платойвидеоввода или сканер, персональный компьютер с установленнойоперационной системой Windows и соответствующим программнымобеспечением.
В России такие комплексы производят НТЦ «Ленхром»(г. С.-Петербург) – денситометр «ДенСкан-04» и «Сорбполимер»(г.Краснодар)–денситометр«Сорбфил».Программаобработкихроматографических данных позволяет выполнять следующие функции:вводить изображения хроматограмм и сохранять их с высоким качеством иразрешением; выделять на введенном изображении хроматограммырабочий участок, на котором будет производиться дальнейшая обработкаизображения; производить автоматический или ручной поиск пятен;проводить обработку пятен, переводить их в форму хроматографическихпиков, рассчитывать значения Rf и площади пиков; измерять содержаниевещества в анализируемых пятнах (в относительных единицах); вводитьзначения концентраций для построения градуировочных зависимостей:линейной интерполяцией; линейной аппроксимацией более чем , через дветочки;квадратичнойсодержаниевеществаинтерполяцией;ванализируемыхавтоматическипятнахповычислятьвведеннымкалибровочным значениям; представлять результаты в виде печатныхдокументов.121Количественную обработку пятна в видеоденситометрии проводятпо двум характеристикам: по площади пятна и его «объему» впространстве, при этом в качестве третьей координаты используют яркость(интенсивность окраски пятна) ( рис.
32).Рис. 32. Вид пространственного распределения яркости в области пятна:Аi,j – значение уровня яркости точки пятна; Вi,j- значение уровня яркоститочки на базовой поверхности.5. Денситометрия с планшетным сканером с программнымобеспечением для обработки хроматограмм практически не отличающимсяот стандартных программ, применяемых для видеоденситометров, носущественно меньшей стоимости.
При этом сканирование дает болеечеткое изображение хроматографических зон, что можно объяснитьпониженным влияниемнеравномерностиосвещенияанализируемыхобъектов, чем в случае видеоденситометра (рис. 33).Применение для решения практических задач. Применение ТСХособенно эффективно для предварительного разделения (по классам,группам, видам веществ) компонентов сложных смесей органическихзагрязнителей воды, почвы и воздуха.
Индивидуальная идентификация спомощью одной лишь ТСХ122Рис. 33. Хроматограммы, полученные при разделении красителейазорубина (1) и амаранта (2) с применением системы ввода изображения спомощью видеоденситометра «ДенСкан-2» (слева) и планшетного сканера«Mustek Scan Express» (справа): а – полутоновое изображение рабочейобласти; б – денситограммы; в – 3D-изображение рабочей области;г – 3D-изображение области разделения пиков.123затрудненаиз-заотсутствиявыокочувствительныхиселективныхдетекторов, кроме того, определение целевых компонентов менее точно,чем в случае ГХ и ВЭЖХ.
Часто ТСХ применяют на первом этапе анализадля разделения сложных и многокомпонентных смесей органическихсоединений на отдельные более простые группы, и уж потом проводятболее детальное исследование этих групп «более тонкими» методами (ГХ,ВЭЖХ, ЯМР, ИК или масс-спектрометрией).Использование ТСХ при анализе загрязненной пресной и морскойводы открывает широкие возможности для препаративного разделения,предшествующего другим методам, разделения искомых примесей идополнительной идентификации. ТСХ используют для обнаружения иполуколичественногоповерхностно-активныхопределениявеществвеществ,углеводородов,разнойПАУ,природы:фенолов,пестицидов.Для определения неионных ПАВ в сточных и речных водахиспользуют пластинки со слоем силикагеля или Кизельгеля G.
Напластинку наносят хлороформенный экстракт ПАВ и разделяют их прииспользовании в качестве подвижной фазы смесей этилацетат : вода :уксусная кислота. Обнаруживают пятна при опрыскивании смесью:реактив Бургера : фосфорная кислота : этанол : 5% раствор BaCl2.2H2O(10:1:10:5). ПАВ проявляют в виде розовых пятен. Метод позволяетопределить в воде от 0,1 до 1,0 мг/л неионогенных ПАВ. Из сточных вод вэтих условиях экстрагируются ионные ПАВ, но они движутся вместе сфронтом растворителя и не проявляются.Предложено много методик определения фенолов. Хлорфенолыразделяют на пластинках с оксидом алюминия при многократномэлюированиибензоломилинасиликагелевыхпластинкахприэлюировании смесью бензола и петролейного эфира (1:1).